Spektrofotometri

Hva er fotometri?

Fotometri er en målemetode for å fastslå konsentrasjonen av fargede løsninger ved hjelp av elektromagnetisk stråling, også kjent som «lys». Det er hele grunnlaget for spektrofotometri. Konsentrasjonen av en bestemt forbindelse bestemmes ved økning eller reduksjon av absorptansen til løsningen, som skyldes en spesifikk fargereaksjon av den aktuelle forbindelsen. Stoffene som skal undersøkes i fotometriske målinger kan kreve forbehandling for å bli fullstendig oppløst.

Fast stoff må omdannes til en oppløst form ved passende dekomponeringsprosesser. Det er viktig å finne en fargereaksjon for den aktuelle parameteren som forløper kvantitativt og spesifikt. Derfor er ikke enhver fargeproduserende reaksjon egnet for fotometrisk konsentrasjonsbestemmelse.

Hva er forskjellen på fotometri og spektrofotometri?

Forskjellen mellom spektrofotometri og fotometri ligger i måten man måler og behandler lys. I et filterfotometer isoleres den nøyaktige bølgelengden fra det innkommende polykromatiske lyset ved hjelp av et filter. Denne filtreringen begrenser imidlertid nøyaktigheten av målingene, og avvik kan oppstå mellom maksimumet av absorpsjonsspekteret og den innstilte bølgelengden etter justering. I motsetning til dette bruker en spektrofotometer en monokromator for å isolere den eksakte bølgelengden fra det innkommende lyset. Monokromatoren splitter det polykromatiske lyset ved hjelp av et reflekterende gitter, og kun et smalt bølgelengdeområde overføres gjennom en smal åpning til retning av kyvetten. Dette tillater en skanning over hele bølgelengdeområdet, og et absorpsjonsspektrum av stoffet kan måles, med direkte deteksjon av absorpsjonsmaksima. Spektrofotometri gir også muligheten til å velge hvilken som helst bølgelengde av det innkommende lyset under målingen, og det er ingen avvik mellom absorpsjonsspekterets maksimum og den innstilte bølgelengden etter justering. Denne metoden gjør målingene mer sensitive sammenlignet med filterfotometre.

Elektromagnetisk stråling og spektrofotometri

I fotometrisk analyse bruker man elektromagnetisk stråling i området 190–1100 nm. Lys, definert som den delen av elektromagnetisk stråling som er synlig for mennesker, spenner fra ca. 400 til 700 nm. UV-lys brukes også i fotometri, selv om bare en liten del mellom 315 og 380 nm er synlig for mennesker. Ultrafiolett stråling strekker seg fra 100 nm til 380 nm.

Fotometre bruker tungsten-halogenlamper for synlig lys og deuteriumlamper for UV-lys, da hver lampe alene ikke dekker hele spekteret. Energispektrene for disse lampene viser toppene ved henholdsvis ca. 650 nm og 250 nm.

Hvor kommer fargen i reagensene fra?

Når lys, utstrålt fra en kilde som en lampe, samhandler med en løsning, resulterer det i et spektrum av farger på grunn av spredning av hvitt lys i sine individuelle spektralkomponenter.

Fargen som observeres i en løsning er en konsekvens av selektiv absorpsjon. For eksempel absorberer en gul løsning fiolette og blå komponenter av hvitt lys, noe som fører til oppfatningen av gult på grunn av mangelen på komplementærfargen blå. Omvendt oppstår fiolett farge fra kraftig absorpsjon i det gule-grønne området.

Absorpsjonsegenskapene er oppsummert i denne tabellen:

Lambert-Beer-loven

Lambert-Beer-loven, et grunnleggende prinsipp innen fotometri, etablerer et forhold mellom konsentrasjon (c), lagtykkelse (d) av den absorberende løsningen og absorbans (E). Denne loven fastslår at den relative reduksjonen i intensitet (I) er proporsjonal med både lagtykkelsen og konsentrasjonen av den oppløste absorberende substansen. Transmittans (T) og absorbans (E) er nøkkelparametere, der absorbans er den negative dekadiske logaritmen til transmittans.

Lambert-Beer-loven muliggjør bestemmelse av konsentrasjoner ved å plotte absorbans mot bølgelengde. Hvert stoff viser et spesifikt absorpsjonsspektrum, og lineariteten av kurven avhenger av faktorer som konsentrasjon og lagtykkelse. Å arbeide innenfor det optimale absorbansområdet (0.1–1.0) sikrer nøyaktige målinger og unngår ikke-linjære effekter.

 

 

Hvordan fungerer et fotometer?

 

Strålebanen inne i et fotometer

Hvert fotometer består av nøye utvalgte komponenter. En strålingskilde, vanligvis en tungsten-halogenglamp eller en deuteriumlampe som man finner i NANOCOLOR® spektrofotometere, sender ut polychromatisk lys. Dette lyset fokuseres på prøvekammeret ved hjelp av en optisk linse. I prøvekammeret plasseres en kyvett med prøveløsningen. Når lyset passerer gjennom kyvetten, absorberer fargede stoffer lys av spesifikke bølgelengder basert på deres spektrum.

To typer fotometre: Filterfotometer og Spektrofotometer

Filterfotometre bruker spesielle interferensfiltre for å generere monokromatisk lys ved å «filtrere ut» uønskede bølgelengder. Spektrofotometre bruker derimot en monokromator for å produsere den nødvendige bølgelengden. Den resulterende, begrensede lysstrålen brukes til fotometrisk evaluering.

Filterfotometer: Interferensfiltre med glassplater belagt med flere semi-transparente dielektriske lag brukes i filterfotometre. Disse filtrene kan passere spesifikke bølgelengder av lys. Riktig filter velges basert på fargen på prøven og absorpsjonen av den komplementære fargen. Et viktig hensyn er båndbredden, avstanden mellom øvre og nedre frekvensgrense. Smalere båndbredde gir høyere oppløsning.

Spektrofotometer: I motsetning til filterfotometre, isolerer spektrofotometre den eksakte bølgelengden fra det innfallende polychromatiske lyset ved hjelp av en monokromator. Den tillater skanning over hele bølgelengdeområdet, noe som gir et absorpsjonsspektrum av stoffet.

Følgende video viser en animasjon av hvordan spektrofotometri av vannanalyse fungerer:

Kyvette: Nøkkelen til presis måling ved spektrofotometri

Valget av riktig kyvette er avgjørende for nøyaktige målinger. Materialet (avhengig av bølgelengde) og størrelsen på kyvetten er to viktige faktorer.

Standarden er glasskyvetter, som brukes i NANOCOLOR® tube tester. Runde kyvetter er engangskyvetter som kastes etter bruk. I UV-målinger brukes høykvalitetsmaterialer som kvarts i rektangulære standardkyvetter. Det finnes også spesialkyvetter som «flow-through kyvetter», der prøveløsningen pumpes inn og ut av kyvetten.

Størrelsen på kyvetten er direkte relatert til lagtykkelsen som er effektiv i Lambert-Beer-loven. Generelt sett gir større kyvetter og prøvevolum større lagtykkelse, og målingen blir mer sensitiv. Måleområdet for en kyvette test avhenger av sensitiviteten til den fotometriske testen og kyvettens størrelse. 50 mm rektangulære kyvetter gir høyere sensitivitet, lavest måleområde og maksimal målenøyaktighet.

Bildet illustrerer COD NANOCOLOR reagenstester med økende konsentrasjon av kjemisk oksygenforbruk.

Våre anbefalinger for deg som ønsker et fotometer

Spektrofotometere vi anbefaler for høy nøyaktighet

Du kan lese om andre temaer som analyse av vannkvalitet, kjemisk oksygenforbruk og mye mer under våre informasjonssider.